Costruzione del DNA ricombinante
Per generare del DNA ricombinante, sono necessari il gene ed un vettore con cui muoverlo (generalmente un plasmide). Entrambi vengono tagliati in maniera complementare da un enzima di restrizione, formando due “monconi” detti appiccicosi. Essi vengono poi legati dalla DNA ligasi. Per trasportare i geni da una specie all’altra, si usano i fagi, per i frammenti più grandi, e i plasmidi, per i frammenti più piccoli.
Quando il microrganismo si riproduce, genera automaticamente copie del DNA ricombinante. A partire da un batterio, in un giorno si possono ottenere circa 10¹⁵ copie, amplficando enormemente il gene stesso e/o la quantità del gene prodotto.
Le genoteche
Dalla clonazione di tutti i frammenti di un genoma, mediante una raccolta di cloni batterici, si ottiene una genoteca. La genoteca umana è stata ottenuta mediante vettori fagi (anzichè batteri) ed è costituita da circa un milione di cloni.
Sono due i tipi di genoteche:
- genoteca genomica: ottenuto dalla frammentazione e successiva clonazione dell’intero genoma, contiene sia sequenze codificanti (esoni) che non codificanti (introni)
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genoteca di cDNA: si ottiene partendo dall’ mRNA totale della cellula. Grazie all’enzima transcrittasi inversa, si ottiene il DNA complementare detto cDNA, privato degli introni e avente quindi solo le sequenze codificanti. Esso viene quindi clonato come il DNA normale, ma essendo le sequenze codificanti il 5% del totale, si risparmiano un bel po’ di sequenze inutili.
Le sonde di oligonucleotidi
Per trovare una determinato gene in una genoteca, è necessaria una sonda che si agganci alla sequenza desiderata. Le sonde sono pezzi di DNA che vannodai 10 ai 1000 nucleotidi, complementari della sequenza da trovare. Per realizzare una sonda è necessaria la conoscenza a priori del gene. Nel caso non la si abbia, si parte dalla proteina codificata e si ricostruisce la sequenza di nucleotidi in base a quella di amminoacidi. Il gene pescato viene quindi sequenziato e analizzato.
La PRC
La rezione a catena della polimerasi (PRC, polimerase chain reaction), sviluppata negli anni 80′ da Mullis, permette di amplificare in vitro un segmento di DNA in un numero di copie elevatissimo.
Questa tecnica prevede la fornitura di nucleotidi trifosfato liberi che, per azione della DNA polimerasi, vengono utilizzati per formare nuovi filamenti di DNA a partire da due inneschi detti primer. I primer sono brevi tratti di DNA che devono essere presenti ai due estremi del DNA da replicare. A essi si attacca la DNA polimerasi che poi duplica l’intero filamento.
Sono tre le fasi principali:
- Denaturazione del DNA stampo: l’ambiente viene riscaldato fino alla rottura dei legami a idrogeno (94°). Ogni catena della doppia elica diventa filamento stampo.
- Ibridazione: si abbassa la temperatura (45-65°), permettendo i primer di legarsi al DNA stampo.
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Estensione: in presenza di ioni Mg²⁺, avviene la sintesi dei nuovi filamenti.
Il ciclo si ripete n volte, per ottenere un totale di 2ⁿ di repliche. Ciò viene automatizzato in macchine dette termociclatori.La PRC ha ottimizzato la diagnosi parentale dei difetti genetici, la replicazione di DNA da reperti storici e di tracce di DNA a scopo investigativo.